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A Study on Roles of Naturally Formed Biofilms and Cultured Bacterial Biofilms on Larval Settlement and Metamorphosis of the Mussel Mytilus galloprovincialis


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タイトル: A Study on Roles of Naturally Formed Biofilms and Cultured Bacterial Biofilms on Larval Settlement and Metamorphosis of the Mussel Mytilus galloprovincialis
その他のタイトル: ムラサキイガイ(Mytilus galloprovincialis)幼生の付着・変態に対する海域微生物フィルムおよび培養バクテリアフィルムの役割に関する研究
著者: Bao, Wei-Yang
著者(別表記) : 包, 衛洋
発行日: 2008年 3月19日
引用: (2008-03-19)
抄録: The mussels Mytilus galloprovincialis are distributed in temperate zones from the subtidal to intertidal regions in almost all the oceans. This species is commercially important and cultivated at high densities in many countries. On the other hand, M. galloprovincialis is known as one of the significant macro-fouling organisms because of its colonization on a wide variety of substrata. Thus, understanding of the mechanism of M. galloprovincialis larval settlement and metamorphosis is crucial to either acquaculture or antifouling. M. galloprovincialis, like many sessile invertebrates, produce pelagic larvae that spend several weeks feeding, developing and growing into metamorphic competence. Then larvae search and select a suitable substratum, and are induced to settle and metamorphose by the chemical cue derived from the substratum for the sessile life. However, the mechanism of larval settlement and metamorphosis of M. galloprovincialis is still poorly understood. On the other hand, the biofilm is considered a prerequisite for larval settlement and metamorphosis of many marine invertebrates. Hence, in the present study, the author focused on the role of the biofilm on M. galloprovincialis larval settlement and metamorphosis. The author firstly investigated the settlement and metamorphosis response of M. galloprovincialis larvae to natural biofilms of different ages formed during different months. Effects of age, immersion month, dry weight, bacterial and diatom densities of these biofilms on the settlement and metamorphosis of pediveliger larvae of the mussel Mytilus galloprovincialis were investigated. Furthermore, biofilms were subjected to various treatments to investigate characteristics of the chemical cue in the biofilm. Larvae settled and metamorphosed in response to biofilms, and could differentiate the age and immersion season of the biofilm. The biofilm activity positively correlated with the dry weight, bacterial and diatom densities. These three quantitative parameters of the biofilm were significantly affected by the film age but were not affected by the immersion season, suggesting that other parameters (e.g., community structures, extracellular products) also affected the activity of the biofilm. The fixative agents (formalin and glutaraldehyde), heat, ethanol, ultraviolet irradiation and antibiotics treatments of the biofilm resulted in significant reduction or loss of its inductive activity. The survival of bacterial cells in treated films where activities were either reduced or lost also decreased significantly. Thus, bacteria in the biofilm induce larval settlement and metamorphosis of M. galloprovincialis and their viability were suggested as a requirement for the production of the chemical cue. The cue may be a bacterial extracellular product which was susceptible to the above treatments. Furthermore, bacterial isolates from natural biofilms were identified by 16S rDNA gene sequences, and their inductive effects on M. galloprovincialis larval metamorphosis were investigated using monospecies bioflim. Alteromonas sp. 1 biofilm was found to have inductive activity, which increased with increasing cell density. The chemical cue(s) of Alteromonas sp. 1 biofilm responsible for inducing larval metamorphosis was further investigated. Treatment of the biofilm with formalin, ethanol, heat or ultraviolet irradiation resulted in a significant reduction in the inductive activity of Alteromonas sp. 1, and the crude extract of surface-bound products of the biofilm showed no activity. These results indicated that if the cue was a surface-bound chemical cue, it was unstable, or susceptible to the treatments or the extraction process. On the other hand, the inductive activity of treated biofilms had a linear regression to the cell survival of bacteria, confirming a metabolically active biofilm was a requirement for larval metamorphosis. Conditioned water of the biofilm did not induce larvae to metamorphose. However, larval crawl-searching behavior in the conditioned water was the same as that in the biofilm prior to larval metamorphosis, and significantly different to larval behavior in seawater. This indicated that a potential or partial waterborne cue existed, but remained inactive when alone. A synergistic effect of the conditioned water with formalin-fixed Alteromonas sp. 1 biofilm resulted in a significant increase in larval metamorphosis. Heat treatment and fractionation of the conditioned water demonstrated that the waterborne cue was heat-stable and <3,000 Daltons in molecular weight. Platinum-coating, Lentil Lectin and Wheat Germ Agglutinin treatments of the formalin-fixed biofilm significantly reduced its synergistic effect with the conditioned water, suggesting that a surface-bound cue was present on the biofilm and that the cue might be associated with the bacterial exopolysaccharide or glycoprotein. In conclusion, bacteria in the multispeices biofilm of the sea were demonstrated to produce the chemical cue (s) to induce M. galloprovincialis larval settlement and metamorphosis. Furthermore, evidence of my research firstly showed that two chemical cues derived from bacteria acted synergistically on larval settlement and metamorphosis. The model of two chemical cues inducing M. galloprovincialis larval settlement and metamorphosis in natural systems was further hypothesized. / ムラサキイガイは世界的に重要な水産食品であり、多くの国で養殖されている。一方、本種は発電所取水設備、養殖筏、船などに大量に付着し、被害を与えているため、汚損生物としても知られている。日本では主に汚損生物として注目されている。養殖する場合についても、汚損生物として対処する場合においても、本種幼生の着生を制御することは重要な課題と言える。本種は、多くの海洋無脊椎動物と同様に浮遊幼生期をもち、植物プランクトンを摂餌しつつ成長し、数週間後に成熟した幼生となる。成熟幼生は糸状海藻や微生物フィルムと接触して着生(付着・変態)が起こるとされているが、後者の微生物フィルムについては研究例が少なく、不明な点が多い。そこで、本種幼生の付着・変態に対する海域における微生物フィルム、および分離培養バクテリアフィルムの役割を検討した。まず、長崎市橘湾にスライドガラスを垂下し、その表面にバクテリア、付着珪藻などからなる微生物フィルムを形成させた。フィルムの垂下日数、垂下時期、付着重量、および構成生物(バクテリア、付着珪藻)と幼生の付着・変態との関係を調べるとともに、フィルム由来のケミカルシグナルの性質を調べた。海域微生物フィルムの誘起活性は、垂下日数と共に上昇し、その傾向は水温の高い時期に速く、水温の低い時期には遅いことが判明した。フィルムの重量、付着バクテリアおよび付着珪藻の密度が上昇するに伴い、フィルムの活性は上昇した。これらの結果より、フィルムの量的な要因が幼生の付着・変態に影響するものと考えられた。微生物フィルムの誘起活性は、ホルマリン、グルタルアルデヒド、熱、エタノールなどの各処理によって消失した。これらより、フィルムのケミカルシグナルは化学的に不安定な物質、または揮発性物質と思われた。一方、海域の微生物フィルムを抗生物質により処理したところ、活性が低下しことから、活性にはバクテリアが関与していることが判明した。また、バクテリアの生残率と活性とは関連しており、バクテリアが生存しているときにケミカルシグナルを生産していると考えられた。次に、海域微生物フィルムよりバクテリア数株を分離し、単一種培養バクテリアフィルムを形成させ、各々の活性を調べたところ、Alteromonas sp .1フィルムに活性が認められた。本種の密度が上昇するに従い、活性が上昇した。本フィルムの活性はホルマリン、エタノール、熱処理によって消失した。また、フィルムの活性と生残率とには正の直線関係が認められ、バクテリアの生存は活性に関わることが確認できた。本株フィルムより得られた浸漬液に幼生を暴露したところ、稚貝は出現しなかったが、付着行動を示す幼生が6 割ほど観察された。これより、浸漬液には幼生の付着行動を誘起するケミカルシグナルが存在することが推測された。一方、幼生はフィルムの表面で稚貝となっており、フィルム表面には接触によって変態を誘起するケミカルシグナルがあるものと思われた。これら2つのシグナルの組み合わせによって、幼生の付着・変態がおこるものと考えられた。そこで、活性が消失したホルマリン固定フィルムに、浸漬液を添加したところ、新鮮フィルムと同様の高い活性が認められた。これより、2 つのケミカルシグナルの併用効果によって幼生の付着・変態が誘起されているものと結論できた。浸漬液について、熱処理、限外ろ過した結果、ケミカルシグナルは熱に安定であり、分子量が3000Da 以下の物質であることが分かった。一方、フィルム表面関連のケミカルシグナルについては、固定フィルムを白金コーティング(SEM)したところ、活性は低下した。また、数種レクチンで処理した結果、LCA、WGA によって活性が低下した。これより、これらのレクチンと特異的に結合する糖関連物質が表面関連のシグナルであると推察された。以上のように、海域の微生物フィルムの構成生物ではバクテリアが本種幼生の付着・変態に関わっていることが明らかとなった。さらに、バクテリア由来の2 つのケミカルシグナルが関わっており、一つはフィルムが放出する低分子物質であり、濃度勾配的に付着を制御し、他の一つは、フィルムの表面に存在するLCA、WGA 結合型糖関連物質であり、変態を誘起するものと推察された。これらの知見は、種苗生産技術の改善、および汚損生物としての着生制御に貢献すると判断される。
記述: 長崎大学学位論文 学位記番号:博(生)甲第145号 学位授与年月日:平成20年3月19日
URI: http://hdl.handle.net/10069/20901
関連リンク : http://hdl.handle.net/10069/20701
資料タイプ: Thesis or Dissertation
出現コレクション:090 学位論文

引用URI : http://hdl.handle.net/10069/20901

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